SLC10A2基因与胆管壁绒毛在胆囊切除术后原发性胆管结石形成中的作用机制
马磊，戴建国，陈志勇，陈志洪
作者单位:医院肝胆外科,上海
原发性胆总管结石是胆囊切除术后常见的并发症之一，严重影响胆囊切除术后患者的生活和身体健康[1-2]。笔者在临床实践中发现胆囊切除后患者胆管壁有绒毛出现，而绒毛与胆总管结石形成是否相关，需要进一步探讨。同时有研究发现SLC10A2单核苷酸基因多态性与胆结石形成相关[3]，但是其表达是否与有绒毛特征的胆总管结石形成有关，截止目前没有相关研究报道。因此本研究旨在分析胆囊切除后胆管壁绒毛形成与胆总管结石直接的相关性以及拟检测SLC10A2基因表达，初步探讨其中的分子机制。
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资料和方法
1.1一般资料
以年3月至年3医院行胆囊切除术后的40例患者作为研究对象。其中男22例，女18例；年龄32～72岁，平均(51.2±3.4)岁。根据有无胆管壁绒毛分为2组：实验组(n=20)，有绒毛形成特征；对照组(n=20)，无绒毛形成特征。手术方式为开腹手术。对比分析两组的年龄、性别、糖尿病史等基本资料，差异无统计学意义(P＞0.05)，详见表1。
表1两组病例基本特征
所有患者均符合诊断胆囊切除术后原发性胆总管结石的诊断标准：(1)不存在既往胆管手术史；(2)发现胆总管结石的时间为胆囊切除术后2年以上；(3)不存在既往手术致使胆管狭窄的证据。
1.2试剂和方法
1.2.1主要试剂
RNA反转录试剂盒、SYBRGreenPCRMasterMix试剂盒、SLC10A2引物、GAPDH引物购于上海博尚公司；RNA提取试剂盒及Trizol购于美国Invitrogen公司；SLC10A2抗体购自于Abcam公司。
1.2.2实时荧光定量PCR（RT-PCR）
根据用户说明书用Trizol从相应组织中提取总RNA。20μLRNA根据RNA逆转录试剂盒说明书反转录成cDNA。取反转录产物，按照SYBRGreenPCRMasterMix试剂盒说明书在RTPCR仪(美国Bio-Rad)上进行PCR反应。反应体系：1μLcDNA(ng/20μL)，0.6μLprimer(10pmol/L)，10μL2×SYBRGreenPCRMasterMix，无RNase水8.4μL。反应条件：95℃5min预热，95℃30s变性，60℃30s退火，72℃30s延伸，40个循环。引物序列，5：正向引物5′-GCTGACTTGCACACCTGA-3′，反向引物5′-GTGCGCTACATCTAGT-3′；GAPDH：正向引物5′-AGCCACATCGCTCAGACAC-3′，反向引物5′-GCCCAATACGACCAAATCC-3′。反应结束后得到各反应管的循环阈值(Ct)，SLC10A2的相对表达量采用2-△△Ct法对基因表达量进行相对定量。
1.2.3Westernblotting
用RIPA裂解液裂解组织提取蛋白，30μg蛋白于10%分离胶与4%浓缩胶中进行垂直电泳(40V×60min，90V×60min)和电转膜(10V恒压半干转50min)；PVDF膜于5%牛血清蛋白BSA封闭2h后，SLC10A2抗体4℃孵育过夜，次日室温孵育二抗2h后进行显影。
1.3统计学分析
用SPSS18.0统计软件进行数据分析。计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
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结果
2.1胆囊切除术后胆管壁有绒毛形成
如图1所示，收集临床病例图片，证实胆囊切除术后的确有绒毛形成，且胆总管结石出现。
A：胆总管绒毛；B：胆总管壁绒毛突起；C：胆总管结石形成；D：胆总管结石图1胆囊切除术后胆管壁绒毛形成
2.2胆管壁绒毛与胆总管结石形成的关系
为进一步研究胆管壁绒毛出现与胆总管结石的形成直接是否存在相关性，我们对两组患者的基本病例特征进行比较，结果如表1所示。与对照组相比较，实验组患者发生胆总管结石的比例明显增加，差异有统计学意义(χ2=8.，P=0.)。
2.3SLC10A2与有绒毛特征的胆总管结石形成
为进一步探索有绒毛特征的胆总管结石形成的具体分子机制，我们通过RT-PCR和Westernblotting检测SLC10A2基因表达，结果表明，实验组中的SLC10A2在转录水平和蛋白水平都显著性下调(P＜0.05)。见图2。
A：两组SLC10A2mRNA的表达情况；B：两组SLC10A2蛋白表达情况(1表示对照组，2表示实验组)图2RT-PCR和Westernblotting检测SLC10A2表达情况
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讨论
目前，胆囊切除术已成为临床上治疗胆囊结石、胆囊炎的主要方法[4]。而作为临床上一种常见胆道系统疾病，胆囊切除术后原发性胆总管结石有较高的发生率[5]。原发性胆总管结石多发于术后2年以上，多数原发性胆总管结石患者临床表现出高热、腹痛、寒战等症状，严重影响患者身心健康和生命质量[6]。但目前对胆囊切除术后形成结石的机理还不清楚，有文献报道，饮酒、吸烟、糖尿病以及手术方式和高血压等因素会影响到胆囊切除术后结石的形成，但患者的年龄、身高、性别、高密度脂蛋白血症等因素与胆总管结石形成无关联。可能原因在于胆总管结石属于代谢性疾病，而饮酒、吸烟糖尿病、高血压等因素会影响人体体内代谢，从而进一步导致胆囊切除后胆总管形成结石[7-9]。本研究发现胆囊切除术后患者胆管壁出现绒毛特征，通过临床图片进行确认，并与未形成绒毛特征患者的资料进行比较发现，具有绒毛特征的患者发生胆总管结石的概率明显增加，与未形成绒毛特征患者相比有统计学差异(P＜0.05)，提示胆管壁绒毛出现可能与胆囊切除术后胆总管结石形成有关。但本文中纳入的患者样本数较少，还需要更多样本进行研究以进一步确认。有文献报道，基因SLC10A2突变可导致胆酸吸收障碍以及引起微环境改变，同时也有文献发现SLC10A2单核苷酸多态性与胆总管结石形成有关[10-12]，据此提示，我们推测胆囊切除后胆管壁绒毛出现可能与SLC10A2的表达有关，因此我们通过RT-PCR和免疫印迹技术对SLC10A2在绒毛出现的患者和未出现患者的样本进行检测，发现绒毛出现的患者中存在SLC10A2转录和蛋白水平显著性低表达(P＜0.05)，该结果提示，SLC10A2可能在绒毛出现的胆总管结石形成中具有重要作用，参与胆总管结石进程。
综上所述，胆囊切除术后胆管壁绒毛出现与胆总管结石有紧密相关性，以及SLC10A2在绒毛出现的胆总管结石患者中具有重要作用，从而为临床上治疗胆总管结石提供了科学依据。但是由于样本量过低，本研究后期将收集大量临床样本，进行统计分析，获取更为准确可靠的分析数据。
引证本文：
马磊，戴建国，陈志勇，陈志洪SLC10A2基因与胆管壁绒毛在胆囊切除术后原发性胆管结石形成中的作用机制[J].肝胆胰外科杂志，,29(3):-,
肝胆胰外科杂志
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